System przetwarzania tkanki zęba na autogenny materiał kościotwórczy

BonMaker to realizacja wieloletniej idei wykorzystania struktury zęba jako materiału kościotwórczego. W 2004 r. koreańscy lekarze opracowali procedurę przetworzenia rozdrobnionego zęba po ekstrakcji w granulat wykorzystywany do augmentacji kości.
Jest to najlepszy, najbezpieczniejszy dostępny materiał autogenny, zawierający własny materiał genetyczny, uzyskany bez konieczności zabiegu chirurgicznego, o identycznych właściwościach jak kość pacjenta. Umieszczenie w zębodole nie wywołuje żadnych reakcji immunologicznych, nie powoduje żadnych powikłań, a gojenie i odbudowa kości następują bardzo szybko.

Wprowadzenie

Rosnąca popularność implantologii doprowadziła do wzrostu wymagań dotyczących regeneracji kości wyrostka zębodołowego. Autogenny przeszczep kostny jest wciąż złotym standardem dla augmentacji kości ze względu na jego świetną osteoindukcję i osteokondukcję, ale wiążą się z nim pewne przeszkody jak np. ograniczona dostępność, powikłania w miejscu biorczym i wysoka resorpcja sięgająca 50%.
Wśród alternatywnych materiałów wszczepowych stosowanych klinicznie występują allografty, ksenografty i alloplastyczne wszczepy kostne. Mają pewne wady jak np. wysoki koszt i ograniczona osteoindukcja. Wśród nich zdemineralizowane liofilizowane
allografty (DFDBA) były szeroko stosowane do augmentacji kości wyrostka, ze względu na ich naturalną strukturę i zawartość czynników wzrostu jak np. białka morfogenetyczne kości (BMP), odkąd wykonano pierwszą zakończoną sukcesem augmentację kości z użyciem DFDBA u ludzi w 1981r. Jednakże DFDBA niesie ryzyko przenoszenia chorób. Tak więc rozwój alternatywnych materiałów, które byłyby pozbawione tych niedoskonałości jest oczekiwany.
Budowa i skład zębiny są podobne do kości, składając się kolagenu (20%), hydroksyapatytu (70%) i płynu ustrojowego (10% - wagowo); dlatego jest rozpatrywana pod kątem właściwości osteoindukcyjnych. Ponadto macierz zębinowa ma pewne właściwości osteoindukcyjne ze względu na zawartość BMP. Tak więc oczekuje się, że zębina czy macierz zębinowa posłuży jako substytut kości. Kilka badań wykazało, że zmineralizowana macierz zębinowa posiada świetną biokompatybilność, ale jest mniej efektywna w tworzeniu kości niż materiały kościopochodne. Jednakże, kilka badań na zwierzętach pokazały, że zdemineralizowana macierz zębinowa (DDM) jest nie tylko biokompatybilna, ale również ma właściwości osteoindukcyjne, podobnie jak zdemineralizowana macierz kostna.
Gomes i wsp. jako pierwsi zaobserwowali, że kliniczne zastosowanie autogennej krojonej DDM do zębodołu poekstrakcyjnego trzeciego trzonowca żuchwy wykazało nieco lepsze gojenie zębodołu.
Kim i wsp. zastosowali drobiny zmineralizowanej zębiny i zdemineralizowanej macierzy zębinowej w zabiegu wszczepienia implantu i odnotowali pomyślną regenerację kości.
Często spotykamy przypadki, które wymagają ekstrakcji zębów przed rehabilitacją jamy ustnej z użyciem implantów. Byłoby korzystne gdybyśmy mogli wykorzystać usunięte zęby, które są zwykle wyrzucane, jako autogenny materiał wszczepowy. Jednakże, są ograniczone informacje dotyczące odpowiedniej formy macierzy zębinowej, która mogłaby być użyta jako zamiennik kości.
To badanie na zwierzętach ma na celu określenie właściwego stopnia demineralizacji i wielkości drobin macierzy zębinowej dla regeneracji kości.

Materiały i metody

Przygotowanie drobin zębinowych
Komisja etyczna do badań klinicznych Uniwersyteckiego Szpitala Nagasaki zatwierdziła to badanie. Usunięte zęby zdrowych ludzi były zebrane z kliniki chirurgii stomatologicznej za zgodą pacjentów. Wykorzystano żywe i martwe usunięte zęby, z których usunięto tkanki miękkie, kamień, uzupełnienia protetyczne i wypełnienia kanałów; i zmielono je w młynku udarowym (Polymix PX-MFC 90D; Kinematica AG, Szwajcaria). Drobiny były zebrane i przesiane przez kilka sitek (180-212μm, 425-600μm, 800-1200μm) i rozdzielone na grupy: 200μm (ziarna o śr. 180-212μm), 500μm (ziarna o śr. 425-600μm) oraz 1000μm (ziarna o śr. 800-1200μm) i wypłukano je dokładnie w 1M roztworze chlorku sodu.


Przygotowanie zdemineralizowanej macierzy zębinowej
Drobiny zębiny były zdemineralizowane w 2% roztworze HNO₃ i rozdzielone do trzech grup wg stopnia demineralizacji; niezdemineralizowana zębina (UDD), częściowo zdemineralizowana zębina (PDDM), która była odwapniona w 70% i całkowicie zdemineralizowana macierz zębinowa (CDDM).
Czas odwapniania dla każdej wielkości drobin był podyktowany przez pomiar zawartości wymywanego Ca w roztworze i pozostającego Ca w zębinie w czasie,
używając zestawu Calcium E test (Wako, Japonia). Następnie, każda DDM drobina była obficie podwójnie płukana w 1M roztworze Tris-HCl (pH7,4) przez 10 min.


Implantacja i pobranie DDM z ubytku kostnego czaszki szczura
To badanie było przeprowadzone w ściśle określonych warunkach wg przewodnika o hodowaniu i użyciu zwierząt laboratoryjnych Narodowego Instytutu Zdrowia. Komitet do badania zwierząt Uniwersytetu Nagasaki zatwierdziła protokół badania.
Badanie przeprowadzono z użyciem 100 8-tygodniowych szczurów. Wykonano 6mm ubytki kostne w czaszkach zwierząt. W każdej z 9 eksperymentalnych grup użyto materiał wszczepowy, który był wykonany z 20mg drobin zębiny. Kontrolny ubytek pozostawiono pusty. W tym badaniu pięć szczurów użyto do każdej eksperymentalnej grupy. Po 4 i 8 tygodniach szczury uśpiono eterem i pobrano próbki zawierające wszczepy.

   

 

Analiza radiograficzna

Próbki zeskanowano z użyciem mikrokomputerowej tomografii (μCT) w standaryzowanych warunkach. Przy użyciu oprogramowania analizy struktury 3D μCT zrekonstruowano zdjęcia czaszek i poddano analizie morfometrycznej.

Analiza histologiczna i immunohistochemiczna

Po analizie radiograficznej próbki były przygotowane przy użyciu standaryzowanych procedur dla histologicznych i immunohistochemicznych analiz. W skrócie, próbki wymieszano z 4% paraformaldehydem w 0,1M roztworze PBS-buforowany roztwór soli (pH7,4) i odwapniano w 0,5M roztworze EDTA (pH7,8) przez 10dni. Po odwapnieniu każda próbka została poprzecznie podzielona na dwa bloki, dokładnie wzdłuż centrum oryginalnego cięcia chirurgicznego, przetworzone i osadzone w parafinie, wykonano poprzeczne szeregowe przekroje o grubości 5μm. Przekroje były barwione hematoksyliną i eozyną (HE) i odpornym na winian kwasem fosforowym (TRAP). Osteokalcyna była wykryta immunohistochemicznie.
(przyp. tłum. Osteokalcyna jest syntetyzowana przez osteoblasty, odontoblasty i hipertroficzne chondrocyty. Jest uważana za wysoce swoisty marker wielkości obrotu kostnego i świadczy o aktywności osteoblastów. Jest uwalniania z osteoblastów, ale nie wpływa na kości.)
Dla analizy immunohistochemicznej, barwienie bez podstawowych przeciwciał było przeprowadzone jako próba negatywna. W skrócie, przekroje zostały zablokowane 0,1% roztworem BSA (albumina surowicy bydlęcej) w PBS i inkubowane przez 20min. Podstawowe przeciwciała w rozcieńczeniu 1:100 były dodane do każdego przekroju i inkubowane w 37°C przez 30min. Do przekrojów zastosowano kompleks ABC (VECTASTAIN Elite ABC Kit, Vector Laboratories, USA) po inkubacji z biotynylowanymi przeciwciałami wtórnymi. 3,3’- diaminobenzydyna (ImmPACT DAB, Vector Laboratories, USA) została użyta jako chromagen i przekroje były barwione ze światłem Methyl zielonym. Te przekroje były badane pod fotomikroskopem (Nikon digital sight DS.-U2, Nikon Co, Japonia).

Ilościowa analiza mikrograficzna

Mikrografia świetlna barwionych przekrojów z HE (eozyną) była wykonana do histomorfometrycznych pomiarów. Wykonano 4 przekroje z każdej próbki i zrobiono fotografie ogólnego ubytku. Zawartość procentowa nowoutworzonej kości w ubytku była oceniana jako obszar nowoutworzonej kości do obszaru ubytku oryginalnie utworzonego (n-Bone%). Podobnie, zwartość procentowa pozostałego wszczepu w ubytku była oceniana jako obszar pozostałego wszczepu do obszaru ubytku oryginalnie utworzonego (r-Imp%). Te obszary były określone ilościowo używając komputerowego oprogramowania NIH (Image-J).

Analiza statystyczna

Jednokierunkowa analiza zróżnicowania (ANOVA) z użyciem testu Tukey-Kramer by porównać wskaźniki między grupami. Różnice były uznane za znaczące w przypadku p<0,05 czy p<0,01.
Kultury osteoblastów na płytkach UDD i DDM
Pierwotne osteoblasty były wyizolowane z czaszki noworodka przez sekwencyjne trawienie 0,1% kolagenozą i 0,2% dyspazą. Osteoblasty z trzeciej do piątej frakcji były zebrane i rozprowadzone na płytce (10*5*2mm) UDD i DDM z αMEM, 10%FBS (bydlęca surowica płodowa) i 1% penicylinę/streptomycynę używając 48-dobrych płytek. Komórki hodowano i obserwowano przez 10dni ze średnimi zmianami co 3dni, a adhezja komórek do macierzy była następnie oceniana w mikroskopie skaningowym (TM-1000 Miniscope, Hitachi, Japonia).

Wyniki

Przebieg w czasie demineralizacji drobin zębiny
W czasie przygotowywania DDM, koncentracja wymytego Ca w roztworze i pozostałego Ca w zębinie były monitorowane dla każdej wielkości drobin zębiny podczas procesu demineralizacji 2% roztworem HNO₃. W drobinach wielkości 200μm wymyty Ca a także pozostały Ca wykazały strome nachylenie krzywej w czasie 20minut i osiągnęły plateau po 60minutach. W drobinach 500 i 1000μm, wykazano delikatną krzywiznę w porównaniu z drobinami wielkości 200μm i osiągnięcie plateau po 120 i 180minutach, odpowiednio. W nawiązaniu do tych wyników, 70% demineralizacja zębiny zajęła 5, 10 i 20 minut a kompletna demineralizacja zębiny

Analiza μCT
Z punktu widzenia stopnia demineralizacji, puste przestrzenie pomiędzy drobinami były często obserwowane we wszystkich wielkościach wszczepionych drobin CDDM po 4 i 8 tygodniach po zabiegu. Jednakże, przestrzeń wydawała się być wypełniona nowoutworzoną kością we wszystkich wielkościach wszczepionych drobin PDDM, zwłaszcza po 8 tygodniach od zabiegu. Z punktu widzenia wielkości drobin, większe drobiny wydawały się indukować tworzenie większej ilości kości. Wręcz przeciwnie w przypadku drobin UDD pozostałych w ubytku we wszystkich próbkach i przestrzenie pomiędzy drobinami UDD pozostały, za wyjątkiem drobin wielkości 1000μm, po 8 tygodniach.
Histologiczne obserwacje przekrojów barwionych eozyną w małym powiększeniu
Groty strzałek wskazują brzeg oryginalnego ubytku kostnego. W kontroli zaobserwowano powstanie małej ilości kości, i tylko na brzegach ubytków po 4 i 8
tygodniach. Obszar nowopowstałej kości był ograniczony tylko do UDD w prawie wszystkich próbkach. Nowopowstała kość była widoczna w niektórych obszarach tylko w próbkach z drobinami wielkości 1000μm. W tych próbkach było kilka osteoblastów i osteoklastów a konfiguracja UDD nie wykazała oczywistych zmian.
Formowanie nowej kości wokół PDDM wraz z dobrze zorganizowaną tkanką łączną i tkanką kościopodobną było wyraźnego 4 tygodniach, zwłaszcza w przypadku próbek z drobinami wielkości 1000μm. Nowopowstała kość i PDDM były złączone i całkowicie zamknięcie ubytku nową kością było obserwowane po 8 tygodniach.
Co do CDDM, ograniczona ilość formującej się nowej kości była zaobserwowana w próbce drobin wielkości 1000μm po 4 tygodniach. Po 8 tygodniach nowopowstałą kość była widoczna i prawie cały CDDM był zastąpiony nowoformującą się kością w próbce CDDM o wielkości drobin 1000μm. Wręcz przeciwnie, mała ilość formującej się kości była obserwowana w 200μm i 500μm próbkach; kilka macierzy zresorbowało się a ubytki wypełniły się tkanka łączną w próbkach z 200μm drobinami.

Analiza histomorfometryczna

Ilość nowopowstałej kości (n-Bone%) i pozostałego wszczepu (r-Imp%) były mierzone w analizie histomorfometrycznej.
Po 4 tygodniach wskaźnik n-Bone%
dla próbek UDD 200μm, 500μm i 1000μm były 1,9%, 2,7% i 5,6%;
dla próbek PDDM 200μm, 500μm i 1000μm były 10,4%, 11,1% i 26,0%;
dla próbek CDDM 200μm, 500μm i 1000μm były 4,1%, 2,1% i 12,6%.
Znacząca różnica tego wskaźnika była obserwowana pomiędzy PDDM i innymi grupami dla każdej wielkości drobin. W grupach PDDM i CDDM wskaźnik n-Bone% dla próbki 1000μm wykazała znaczącą różnice z próbkami drobin wielkości 200μm i 500μm. Wskaźnik r-Imp%
dla próbek UDD 200μm, 500μm i 1000μm były 24,1%, 34,1% i 37,9%;
dla próbek PDDM 200μm, 500μm i 1000μm były 27,3%, 36,1% i 38,5%;
dla próbek CDDM 200μm, 500μm i 1000μm były19,8%, 26,6% i 37,3%.
Znacząca różnica we wskaźniku była obserwowana pomiędzy CDDM i innymi grupami o wielkości drobin 200μm i 500μm.
Po8 tygodniach wskaźnik n-Bone%
dla próbek UDD 200μm, 500μm i 1000μm były3,1%, 5,0% i 11,2%;
dla próbek PDDM 200μm, 500μm i 1000μm były 28,3%, 22,3% i 33,2%;
dla próbek CDDM 200μm, 500μm i 1000μm były 7,2%, 4,3% i 33,0%.
Znacząca różnica we wskaźniku była obserwowana pomiędzy PDDM i pozostałymi grupami w próbkach 200μm i 500μm. W próbce 1000μm, wskaźnik n-Bone% PDDM i CDDM wykazał znaczny wzrost porównywalny z UDD.
Wskaźnik r-Imp%
dla próbek UDD 200μm, 500μm i 1000μm były 12,4%, 22,3% i 35,5%;
dla próbek PDDM 200μm, 500μm i 1000μm były 17,8%, 21,8% i 32,3%;
dla próbek CDDM 200μm, 500μm i 1000μm były 14,3%, 13,7% i 26,8%.
Nie było żadnej znaczącej różnicy we wskaźniku r-Imp% wśród grup UDD, PDDM i CDDM o różnych wielkościach drobin.


Histologiczne obserwacje 1000μm UDD, PDDM i CDDM po 4 tygodniach
Kiedy formowanie nowej kości w przypadku drobin PDDM wielkości 1000μm była lepsza w stosunku do pozostałych wielkości dalej badaliśmy wczesne stadium regeneracji kości dla drobin 1000μm UDD, PDDM i CDDM. Histologicznie. Nowopowstała kość wokół PDDM i CDDM była widoczna i były one połączone. Dojrzewanie nowopowstałej kości z wieloma lakunami zawierającymi osteocyty i niektóre komórki wyściółki na powierzchni nowopowstałej kości były zauważalne. Nowopowstała kość była pokryta osteokalcynododatnimi komórkami. Co ciekawe, TRAP-dodatnie olbrzymie komórki wielojądrzaste były widoczne na PDDM i CDDM, ale nie na UDD.


Kultury osteoblastów na powierzchni UDD i DDM
Kanaliki zębinowe były dobrze widoczne na powierzchni DDM, która była gładka, podczas gdy powierzchnia UDD była niejednolita i drobne zanieczyszczenia były widoczne. Osteoblasty były dobrze przyczepione i rozproszone tylko

Dyskusja

Zademonstrowano, że DDM, zwłaszcza PDDM, była efektywnym substytutem kości dla regeneracji ubytków kości czaszek szczurów w tym doświadczeniu. UDD wykazała znacznie mniejszą aktywność regeneracyjną kości, chociaż liofilizowany allograft (FDBA) wykazuje osteokondukcję i jest klinicznie szeroko stosowany. Może dlatego, że subtelna struktura zębiny jest inna niż kości, chociaż ma podobny do niej skład. Obserwacje w mikroskopie elektronowym wykazały, że prawie żadne osteoblasty nie były widocznie przyczepione do powierzchni UDD, podczas gdy wiele osteoblastów było przyczepionych i rozsianych na powierzchni DDM.
Ekspozycja włókien kolagenowych może być korzystna da adhezji komórek. Inną zaletą demineralizacji dla regeneracji kości jest następująca. Jak wiadomo, zębina zawiera kilka niekolagenowych białek w tym czynniki wzrostu kości jak BMP. Kiedy zębina jest demineralizowana, kanaliki zębinowe mogą stać się szersze i służyć jako kanały uwalniające niezbędne białka, które mogą promować wzrost i różnicowanie osteoblastów.
Turonis i wsp. zauważyli, że ludzki DFDBA (zdemineralizowana liofilizowana kość pochodzenia allogennego) wykazuje znaczną poprawę gojenia rany kostnej w czaszce szczura w porównaniu do FDBA (zmineralizowany liofilizowany allograft). Zauważyli, że mineralna struktura FDBA mogła utrudniać proces remodelingu przez ograniczenie ekspozycji na ‘ukryte’ czynniki wzrostu.
Co ciekawe PDDM miała wyższą aktywność regeneracyjną kości niż CDDM zwłaszcza we wczesnym stadium regeneracji kości. Analiza histologiczna wykazała redukcję wielkości wszczepionych drobin i wypełnienie przestrzeni tkanką łączną, w przypadku implantacji CDDM, zwłaszcza w przypadku mniejszych drobin, w porównaniu do implantacji PDDM. Te obserwacje były poparte analizą ilościową nowotworzącej się kości i pozostającej macierzy zębinowej, zwłaszcza w przypadku mniejszych drobin zbadanych po 4 tygodniach. Sugerują, że resorpcja CDDM pojawia się szybciej niż formowanie kości przez ostokondukcję i osteoindukcję na CDDM. Kolagen jest w większości pochłaniany przez trawienie enzymatyczne. Godny uwagi jest fakt, że znakowane markerem TRAP (kwaśna fosfataza 5) osteoklasty były widoczne na powierzchni PDDM i CDDM ale nie na powierzchni UDD. To sugeruje, że włókna kolagenowe były resorbowane nie tylko enzymatycznie ale także fagocytarnie. Ta resorpcja osteoklastyczna może uwolnić czynniki zawierające mineralną macierz, która inicjuje w połączeniu z osteoblastami formowanie kości. Jest możliwe, że PDDM zawiera więcej czynników wzrostu, które promują osteogenezę, niż CDDM, ponieważ wiele niekolagenowych białek jest uwolnionych z macierzy zębinowej podczas procesu demineralizacji. To może wyjaśnić widocznie lepsze formowanie kości w przypadku zastosowania PDDM niż CDDM.
W badaniu pod kątem wielkości drobin, 800 do 1200μm wykazały lepsze rezultaty w regeneracji kości niż mniejsze, 180 do 212μm i 425 do 600μm, we wszystkich grupach: UDD, PDDM oraz CDDM. Kilka badań skupiło się na wpływie wielkości drobin materiału wczepowego na regenerację kości. Jednakże, nie ma konsensusu dotyczącego optymalnej wielkości drobin materiału wszczepowego, ponieważ materiały wszczepowe a także ich właściwości różniły się w każdym badaniu. W wielu badaniach z użyciem nieorganicznych materiałów jak drobiny kości wołowej i FDBA uzyskano lepsze formowanie kości, a także większą absorpcję mniejszych drobin wielkości około 300μm.
Z drugiej strony, badanie z użyciem drobin świeżej autogennej kości lub DFDBA wykazały lepsze formowanie kości z większymi drobinami wielkości około 1000μm. W tych badaniach małe drobiny były resorbowane przed zainicjowaniem formowania kości i podobny fenomen był zaobserwowany w przypadku grupy CDDM (w badaniu, którego dotyczy artykuł). Mezenchymalne komórki zawierające osteoblasty i komórki prekursorowi osteoblastów mogą przyczepiać się do większych drobin CDDM przed całkowitym zresorbowaniem CDDM. Adhezja tych komórek może zabezpieczać przed resorpcją i inicjować tworzenie kości. Formowanie nowej kości w przypadku drobin CDDM wielkości 1000μm stopniowo dogoniło ten proces w przypadku PDDM po 8 tygodniach. Konsekwentnie, optymalny poziom absorpcji jest decydującym czynnikiem dla lepszej regeneracji kości. Tak więc, małe drobiny są odpowiednie dla wysoko zmineralizowanej tkanki takiej jak FDBA, ale nie dla PDDM czy CDDM. Alternatywnie, równowaga pomiędzy resorpcją macierzy i formowaniem kości na macierzy jest istotna dla optymalnej regeneracji kości, uważa się że PDDM ma optymalne warunki.
PDDM z dużymi drobinami (1000μm) wykazała najlepszą regenerację kości w ubytkach kości czaszek szczurów. Mimo, że 70% demineralizacji użyto dla PDDM, różne stopnie demineralizacji, np. tylko powierzchniowa demineralizacja, może przynieść lepsze rezultaty. W kwestii wielkości drobin, jest możliwe że mieszanina drobin różnej wielkości może dawać lepsze efekty. Dalsze badania są konieczne do określenia najbardziej odpowiednich warunków demineralizacji i wielkości drobin dla klinicznych zastosowań w implantologii.
Korzystne jest wykorzystanie usuniętych zębów jako substytutu kości w implantologii, nawet jeśli istnieją nieliczne przypadki dostępnych zębów, w dodatku o ograniczonej objętości. Mimo to, nie ma ryzyka transmisji chorób jako że jest to autogenna tkanka i nie potrzeba dodatkowych zabiegów w celu uzyskania tkanki odkąd ‘niechciane’ zęby mogą być wykorzystane. W obecnym badaniu, sugerujemy że częściowa demineralizacja była idealna dla regeneracji kości. Częściowa demineralizacja ma kliniczną zaletę, dekontaminacja przyczepionych bakterii, a także zabiera mało czasu, co umożliwia natychmiastowa aplikację usuniętego zęba. Polecamy aplikację PDDM jako substytutu kości w przypadkach gdzie zęby przeznaczone do ekstrakcji są dostępne.

Konkluzje

PDDM z dużymi drobinami około 1000 μm indukowało wyraźną regenerację kości ubytków kostnych, ponieważ PDDM miała odpowiednią powierzchnię dla przyczepu komórek. Jest także wyraźna równowaga pomiędzy resorpcją a tworzeniem kości; jako taki PDDM mogłaby być rozważana jako opcja dla materiałów kościozastępczych. PDDM mogłaby być stosowana klinicznie do regeneracji wyrostka zębodołowego w stosunkowo małych ubytkach kostnych, jak np. do utrzymania kości wyrostka, natychmiastowe osadzenie implantu czy podnoszenie dna zatoki szczękowej z dojściem grzbietowym. Wkrótce PDDM będzie stosowany klinicznie ponieważ jest łatwy do przygotowania a badania kliniczne dowiodły bezpieczeństwa jego stosowania jako autogennego przeszczepu.